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克隆 (電擊) 感受態細胞的常規操作方法

更新時間:2024-12-09      點擊次數:600
TOP-10電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。TOP-10來源于MC1061菌株,是目前實驗室常用的感受態細胞之一,基因型與DH10B高度類似 (DH10B為galE15型,而 TOP-10為galU型)。 
操作說明:
一、0.1cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。 
二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態細胞插入冰中5分鐘,待其融化,加入目的DNA (質粒或連接產物)并用手bo打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。
A.測定轉化效率使用1μl 10pg/μl的對照質粒pUC19;  
B.對于連接產物,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液(10mM TrisHCl,pH7.5;1mM EDTA)重懸,DNA濃度不超過100ng/μl,體積不超過5μl/50μl 感受態。 
三、用200μl槍頭將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。 
四、啟動電轉儀,設置參數:C=25μF,PC=200Ω,V=1.8kV(此為BioRad電轉儀推薦參數,也可按所用電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。  
五、2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700μl不含抗生素的無菌S.O.C.培養基(室溫),用1ml槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50ml離心管(BD Falcon50ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C.培養基至5ml。37℃,225rpm 復蘇60分鐘。
六、5000rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。

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